Molekular- und Zellbiologische Forschung

In dem von der DFG geförderten Projekt „Beschreibung der biomechanischen Eigenschaften von Sphäroiden aus humanen Zellen (Geschäftszeichen ME 4109/5-1)“, welches in Kooperation mit dem Lehrstuhl für Mechanische Verfahrenstechnik der RPTU Kaiserslautern-Landau unter Leitung von Prof. Dr.-Ing. Sergiy Antonyuk durchgeführt wird, werden die biomechanischen Eigenschaften von Sphäroiden bestimmt und durch ein Diskrete-Elemente-Methode (DEM) Modell numerisch beschrieben.

Sphäroide sind 3D-Zellkulturmodelle (Zell-Agglomerate), die aufgrund der 3D-Anordnung der Zellen deren physiologische Situation in Geweben besser widerspiegeln als die traditionelle 2D-Zellkulturmodelle. Aktuelle und zukünftige Anwendungsfelder von Sphäroiden sind die Testung von Arzneimitteln, die Therapie von Knorpeldefekten und das Tissue Engineering. Die kugelförmigen Sphäroide können aus einem Zelltyp (Mono-Kultur) oder verschiedenen Zelltypen (Co-Kultur) bestehen, die in einem Agglomerat miteinander verbunden sind. Durch Anwendung der Liquid-Overlay-Technik (Abb. 1) können Sphäroide über einen weiten Größenbereich hoch reproduzierbar hergestellt werden. Da es sich um ein lebendes System handelt, kommt es mit der Zeit zu Neuorganisation der Zellen, Bildung von Matrixproteinen und Anpassungen des Zytoskeletts, was Größe, Morphologie und biomechanische Eigenschaften von Sphäroiden sehr stark beeinflusst. Dieser Reifungsprozess ist weitgehend unerforscht, was die Herstellung von Sphäroiden mit definierten biomechanischen Eigenschaften erschwert.

Abb. 1: (A) Schematische Darstellung der Liquid-Overlay-Technik. (B) Größenentwicklung von Sphäroiden aus humanen Fibroblasten über die Zeit [Metzger et al., Cytotherapy, 2011] (C) Phasenkontrastmikroskopische Aufnahme eines Sphäroids aus 50.000 humanen Fibroblasten.

Basis für die erfolgreiche Modellierung der biomechanischen Eigenschaften von Sphäroiden sind experimentelle Daten zu Größe und Form von Einzelzellen und Sphäroiden und deren Wechselwirkungen, sowie immunhistochemische und molekularbiologische Analysen. Konkret werden hierzu rasterelektronenmikroskopische (REM) und transelektronenmikroskopische (TEM) Untersuchungen durchgeführt, um Größe und Form der Sphäroide und der Einzelzellen in Abhängigkeit des Reifegrades und der Größe der Sphäroide zu bestimmen (Abb. 2). Biochemisch werden Proteine der extrazellulären Matrix, des Zytoskeletts und der Zell-Zell-Adhäsion durch immunhistochemische Färbungen, Genexpressionsanalysen sowie quantitative SDS-PAGE analysiert.

Abb. 2: (A) Kolorierte rasterelektronenmikroskopische (REM)-Aufnahme eines humanen Osteoblasten-Sphäroids [Cover-Foto]. (B) Lichtmikroskopische Aufnahme eines Semi-Dünnschnitts eines Sphäroids nach Richardson-Färbung. (B) TEM-Aufnahme eines Ultra-Dünnschnitts eines Sphäroids. Einzelne Zellen im Sphäroid können vermessen werden. (C) REM-Aufnahme eines angeschnittenen Sphäroids im Block-Face-Verfahren.

Um die für die Etablierung des DEM-Modells essentiellen Daten zum Deformationsverhalten von Einzellzelllagen und Sphäroiden zu gewinnen, werden am Lehrstuhl für Mechanische Verfahrenstechnik der RPTU Kaiserslautern-Landau verschiedene Kompressionsmessungen an Sphäroiden und auch Einzelzelllagen an einem Nanoindenter (TI-Premier, Bruker) durchgeführt.