Blotting

Als western Blot bezeichnet man eine Abwandlung des Southern Blots zur Detektion und qualitativen und quantitativen Analyse von Proteinen in einem Proteingemisch. Das Verfahren besteht dabei aus mehreren Teilschritten:

1. Vorbereitung der Probe

2. Gelelektrophorese

3. Übertragung der Proteine auf eine Membran (Blotting)

4. Blockierung der Membran

5. Färbung (optional)

6. Nachweisreaktion bzw. Visualisierung

7. Analyse

Vor dem eigentlichen Blotting muss die verwendete Probe zuerst für das Verfahren vorbereitet werden. In aller Regel werden Gewebeproben, Blut oder ähnlich komplexe Gemische als Ausgangspräparat verwendet, die neben den zu untersuchenden Proteinen weitere Bestandteile enthalten. Diese müssen zunächst von den Proteinen getrennt werden. Einige Zielstrukturen liegen auch im Inneren von Zellen oder sogar in einzelnen Zellorganellen, weshalb die Zellmembran aufgebrochen werden muss. Beides erreicht man in der Regel durch eine speziell auf das Zielprotein abgestimmte Kombination aus Waschen und Lysieren mit einer Pufferlösung. Wichtig ist dabei, dass die Pufferlösungen spezifische Protease- und Phosphatase-Inhibitoren enthalten, die die enzymatische Spaltung der Proteine während der Lyse weitestgehend unterbinden. Außerdem kann eine Denaturierung maßgeblich eingedämmt werden, indem die Temperatur der Probe unter 4°C gehalten wird.

In einigen Fällen kann es jedoch sinnvoll sein, einige wenige Zielproteine gezielt zu denaturieren, sodass sie anschließend von spezifischen Antikörpern erkannt werden können.  So können die Proteine zuverlässig extrahiert und der weiteren Verarbeitung zugeführt werden.  Im Anschluss werden die Proteine in der Gelelektrophorese aus der Lösung auf ein Gel übertragen.  

Nachdem die Proteine in der Gelelektrophorese von den übrigen Bestandteilen des verwendeten Präparates separiert wurden, stellt die Übertragung der Fragmente auf eine geeignete Trägermembran, unter Erhaltung des Fragmentmusters, den zentralen Schritt des western Blottings dar.

Dabei wird das Gel zusammen mit der Membran, auf saugfähigem Papier und Schwämmen in eine Kassette gespannt und in eine Pufferlösung eingetaucht. Als Membran stehen drei verschiedene Ausfertigungen zur Verfügung, die sich in ihren Eigenschaften unterscheiden und je nach Ziel des Blottings dafür besser oder weniger gut geeignet sind: Polyvinylidenfluorid (PVDF), Nitrozellulose und Nylon.

Für den western Blot wird häufig PVDF verwendet, da es durch seine hohe Proteinbindungskapazität (170-200µg/cm2) eine höhere Sensitivität bietet als die anderen Materialien. Diese ergibt sich aus der Eigenschaft, dass PVDF Proteine auf zwei Arten bindet: hydrophob und über eine Dipol-Bindung. Durch die hohe Sensitivität kommt es allerdings zu einer stärkeren Hintergrundfärbung der Membran, was die spätere Analyse erschweren kann.

Weitere Vorteile im Vergleich zu Nitrozellulose und Nylon sind die einfachere Handhabung, da PVDF reißfest ist, sowie die fehlende Notwendigkeit, während des Transfers Methanol in der Pufferlösung einsetzen zu müssen. Methanol wirkt als organisches Lösungsmittel und es kann zu einer unbeabsichtigten Fällung kommen. Dabei interagiert Methanol mit Wasserstoffbrückenbindungen und beeinträchtigt intramolekulare, hydrophobe Wechselwirkungen in den Proteinen, entfaltet diese so partiell und provoziert einen Aktivitätsverlust.

Ebenso spielt die Porengröße eine wichtige Rolle, die bei allen handelsüblichen Membranen entsprechend ausgewählt werden kann (0.1, 0.2 oder 0.45µm). Abhängig von der Maschengröße können unterschiedliche Proteine ins Visier genommen werden, die sich in Größe, Masse, Ladung und Form unterscheiden. 

Es existieren zwei Hauptsysteme zur Übertragung des Proteinmusters von dem Gel auf die Membran: wet blotting und semi-dry blotting.  Die wesentlichen Unterschiede zwischen beiden Systemen sind der verschieden große Einsatz von Pufferlösung und der zeitliche Aufwand.

Das wet blotting ist dabei am weitesten verbreitet, da die Effizienz zum Nachweis von Proteinen mit niedrigem Molekulargewicht sehr hoch ist. Grundsätzlich sollte der Einschluss von Luftblasen zwischen Gelplatte und Membran unbedingt vermieden werden, da es ansonsten zu Ungenauigkeiten in der Proteinquantifizierung aufgrund von unvollständiger Übertragung kommen kann. Beim wet blotting kann diesem Umstand sehr einfach durch gründliches Ausstreichen des sogenannten Blotsandwich Rechnung getragen werden. Als Blotsandwich bezeichnet man einen Aufbau, bei dem das Gel zusammen mit der Membran und teils mehreren Lagen von mit Pufferlösung getränktem Filterpapier eingespannt wird.

Es handelt sich dabei um eine Kassette, die ein Verrutschen der Komponenten verhindert und den Aufbau gleichmäßig komprimiert, um die Signalübertragung zu erleichtern. Die Kassette wird dann vertikal in einen Kasten eingesetzt und vollständig mit Laufpuffer (z.B. Tris-Tricine-Gel oder Tris-GlycinGel) bedeckt. Der Laufpuffer enthält bis zu 20% Methanol. Bei dieser Konzentration kommt es noch nicht zu einem Aktivitätsverlust der Proteine, aber ihre Affinität zur Membran wird erhöht, da die Bindung zu SDS gelockert wird. Dies soll höhere Transferraten liefern.

Anschließend wird ein Strom von 30V oder 1A an den Kasten angelegt und die Proteine wandern analog zur Gelelektrophorese durch den Laufpuffer in Richtung der positiven Elektrode. Auf ihrem Weg werden sie von der Transfermembran abgefangen und somit positionsgenau übertragen, wobei die Dauer des Übertragungsprozesses zwischen 60 Minuten und mehreren Stunden schwankt. Um ein Überhitzen des Gels zu vermeiden, werden häufig simple Kühlakkus zum Einsatz gebracht, oder das Blotting wird in einem kühlen Raum durchgeführt.

Allerdings besteht im Vergleich zum semi-dry blotting, der zweiten Variante, ein höherer zeitlicher und technischer Aufwand, was bei der Auswahl des Verfahrens mitberücksichtigt werden muss.

Beim semi-dry blotting wird das Blotsandwich horizontal zwischen die Elektroden gespannt. Dadurch, dass die verwendete Menge an Laufpuffer in diesem Fall lediglich so groß ist, dass das Blotsandwich innerhalb der Kassette vollständig getränkt ist, beläuft sich die Dauer der Übertragung auf 10-60 Minuten unter Anlage von 10-24 V oder 0.1-0.4 A. Eine weitere Zeitersparnis kommt dadurch zustande, dass der Versuchsaufbau weniger aufwendig ist als beim wet blotting.

Bei beiden Varianten entsteht je nach übertragenen Proteinen eine charakteristische Bande auf dem Gel, die nun fixiert und sichtbar gemacht werden muss.

Optional kann das Gel nun angefärbt werden, um die Effizienz der Übertragung nachzuweisen. Zur Färbung stehen verschiedene Alternativen zur Verfügung, wie Coomassie, Ponceau-S-Färbung, kolloidales Gold und Fluorophore auf Seltenerd-Chelat-Basis. 

Im nächsten Arbeitsschritt wird die Membran blockiert, sofern die Proteine später über spezifische Antikörper detektiert werden sollen. Der Grund dafür ist, dass Antikörper ebenfalls Proteine sind und beim Auftragen auf die Membran durch deren hohe Affinität an freie Bereiche binden würden, die nicht bereits durch das Blotting mit Proteinen besetzt sind. Die gebundenen Proteine werden dabei nicht beeinflusst, sofern der Blot vor der Blockierung vollständig getrocknet wurde.   Man rehydratisiert die Membran dann mit Blockierungsreagenzien wie entfetteter Trockenmilch, Rinderserumalbumin oder Gelatine, um alle freien Bereiche zu saturieren und unspezifische Bindungen der später als Sonde eingesetzten Antikörper zu vermeiden. 

Der individuellste Schritt des western Blottings ist die Nachweisreaktion mit spezifischen Antikörpern, wofür eine Vielzahl an Protokollen existiert. Das prinzipielle Vorgehen unterscheidet sich allerdings kaum, sodass man ein Basisprotokoll erstellen kann: Wurde die Membran mit Blockierungsreagenzien behandelt, kann man sich nun zur Detektion des Zielproteins zunutze machen, dass während der vorangegangenen Arbeitsschritte die Antigenfunktion der Proteine nicht beeinträchtigt wurde. Es ist also möglich, spezifische Antikörper auf die Membran aufzutragen, die dann an das Zielprotein binden und dieses so hervorheben. Diese Antikörper werden als primäre Antikörper bezeichnet. Einige Waschschritte entfernen schwächer haftende, unspezifisch gebunden Antikörper von der Membran. Der entstehende Immunkomplex ist allerdings nicht sichtbar. Für eine Visualisierung ist es erforderlich, dass ein sekundärer Antikörper an den primären Antikörper bindet. Dieser sekundäre Antikörper ist gegen konstante Bereiche des primären Antikörpers gerichtet und ist an Enzyme, Radionuclide, Fluoreszenzfarbstoffe o.ä. konjugiert. Der Einsatz eines sekundären Antikörpers bietet außerdem den Vorteil, dass das Signal dadurch verstärkt wird, da mehrere sekundäre Antikörper an einen primären Antikörper binden können. Auf diese Weise wird eine hohe Effizienz gewährleistet. Für welche Option man sich entscheidet, hängt letztendlich von der gewünschten Sensitivität und nicht zuletzt vom finanziellen Spielraum ab. 

Im letzten Schritt wird der Blot analysiert. Das Vorhandensein des Zielproteins wird nun verifiziert und es kann abschließend eine qualitative und quantitative Beurteilung erfolgen. 

Nach erfolgter Immundetektion ist es durch Stripping möglich, die gebundenen Antikörper wieder zu entfernen und die Membran so für weitere Analysen zugänglich zu machen.