Blotting

Southern Blotting ist ein molekularbiologisches und biotechnologisches Verfahren, welches zur Analyse von DNA-Fragmenten benötigt wird.

Dieses Verfahren ermöglicht so die Identifikation einer gesuchten DNA-Sequenz innerhalb der Erbsubstanz. Bei dieser Methode ist keine weitere Entschlüsselung notwendig. Als erstes muss die zu analysierende DNA isoliert und mit Restriktionsenzymen geschnitten werden. Anschließend erfolgt die Auftrennung der DNA anhand ihrer Größe durch die Gelelektrophorese zusammen mit Marker-DNA-Fragmenten bekannter Länge. Durch die Vielzahl der unterschiedlichen Größen der DNA-Fragmente entsteht eine mehr oder weniger einheitliche Bande enganliegender DNA-Fragmente, die optisch nicht mehr zu unterscheiden sind, weshalb diese Banden in den folgenden Schritten sichtbar gemacht werden.

Durch den Einsatz von Alkalien (Laugen) werden die Doppelstränge der DNA in Einzelstränge gespalten. Das Trennmuster, welches durch die Gelelektrophorese entstanden ist, wird auf eine Nylon- oder Nitrocellulosemembran übertragen (=blotten) und auf dieser dauerhaft fixiert.

Für die positionsgenaue Übertragung des Fragmentmusters auf eine Membran wird der sogenannte Kapillartransfer verwendet. Die treibende Kraft ist hierbei ein Flüssigkeitsstrom, der von unten durch das Gel (ausgehend von einem Reservoir) durch die Membran zu einem Stapel saugfähigen Materials läuft. Der entstehende Strom zieht die DNA aus dem Gel mit, welche anschließend in den Maschen der Membran hängen bleibt. Dieses Verfahren braucht zwischen 10 bis 12 Stunden, bis es abgeschlossen ist.

Ein ähnliches Verfahren der Übertragung des Musters auf eine Membran ist der Vakuum-Blot, der ähnlich funktioniert wie der Kapillartransfer. Der Unterschied ist, dass hier das Vakuum die Flüssigkeit durch das Gel und die Membran zieht.

Die letzte mögliche Methode für das Übertragen ist der Elektro-Blot. Hierbei wird die negative Ladung der DNA genutzt. Das Gel liegt auf einer Kathodenplatte, auf dem Gel liegt die Membran und darüber liegt die Anodenplatte. Damit elektrischer Strom fließen kann und sich die DNA in Richtung der Anode bewegt, wird Salzsäure benötigt. Dadurch wandert die DNA aus dem Gel und bleibt an der Membran hängen.

Bei Verwendung von Nitrocellulose-Filtern kann die Haftung der DNA an die Membran durch Erhitzen auf 60 – 70 °C unter Vakuum weiter verstärkt werden. Bei Nylon-Filtern kann eine starke Bildung an die Membran durch Bestrahlung mit UV-Licht erreicht werden, da hier eine kovalente Vernetzung der DNA mit dem Membranfilter entsteht.

Nach der Fixierung auf der Membran werden die DNA-Einzelstränge mit einer radioaktiv, chemisch oder fluoreszierend markierten Gensonde behandelt. Diese Gensonde besteht meist aus einzelsträngiger RNA, welche zur gesuchten DNA-Sequenz komplementär ist.

Wenn sich diese Sequenz irgendwo auf der Membran befindet, so bildet die Sonde dort Basenpaarungen mit dieser aus und bindet deshalb dauerhaft in diesem Bereich (=Hybridisierung). Anschließend werden die unspezifischen Bindungen abgewaschen. Die Nachweismethode unterscheidet sich je nach Art der Gensonde.

Das Entfernen der spezifisch gebundenen Sonde nennt man „Stripping“. Die Membran wird hierzu in eine Stripping-Lösung getaucht und mehrere Minuten erhitzt. Die Basenpaarungen zwischen Sonde und der Zielsequenz werden durch die Hitze aufgebrochen, sodass sich die Sonde ablösen kann. Nun kann die Membran erneut vorhybridisiert und mit einer anderen Sonde behandelt werden.