Northern Blot
Beim northern Blotting handelt es sich um ein Verfahren zum Nachweis bestimmter RNA-Moleküle aus einem RNA-Gemisch. Der Ablauf ist im Folgenden beschrieben.
Zunächst wird das RNA-Gemisch aus der Zelle bzw. dem Gewebe isoliert und dann mittels der Gelelektrophorese der Masse nach aufgetrennt. Anders als beim Southern Blotting, bei welchem mit DNA gearbeitet wird, muss die RNA beim northern Blotting nicht durch Enzyme vorbehandelt werden.
Allerdings müssen hier während der Gelelektrophorese durch das verwendete Gel zusätzlich denaturierende Bedingungen geschaffen werden, damit sich die intramolekularen Wasserstoffbrückenbindungen der RNA auflösen und sie in einem Strang vorliegt. Ist dies nicht der Fall, kann es zu Verfälschungen kommen, da sich die Sekundärstruktur auf das Laufverhalten der Moleküle auswirkt. Aus diesem Grund verwendet man z.B. Formaldehyd-, Alkali-, Glyoxal- oder Harnstoff-Gele.
Die durch die Gelelektrophorese aufgeteilten Moleküle werden nun mittels Blotting auf eine Membran (Nitrocellulose oder Nylon) übertragen. Dies geschieht analog zum Southern Blotting durch die hierfür bekannten Techniken (Kapillar-, Vakuum- oder Elektro-Blot).
Anschließend wird die RNA auf der Membran fixiert. Meist durch Erhitzung oder die Behandlung mit einer speziellen Fixierlösung.
Nun wird auf die Membran eine Lösung mit radioaktiv oder chemisch markierten Gensonden gegeben. Als Gensonden bezeichnet man DNA-Stücke, die komplementär zu der gesuchten RNA-Sequenz sind und im Zuge der sogenannten Hybridisierung zur gesuchten Sequenz Bindungen ausbilden. Nicht hybridisierte Gensonden werden anschließend abgewaschen.
Zuletzt werden die hybridisierten Gensonden, wenn notwendig, sichtbar gemacht. Bei radioaktiv markierten Sonden geschieht dies beispielsweise durch einen Röntgenfilm. Es gibt aber mittlerweile auch fluoreszierende Markierungen, welche nicht zusätzlich sichtbar gemacht werden müssen.
Nun kann die Menge der RNA, also die Transkript-Menge, und somit auch die Aktivität des hierfür codierenden Gens abgelesen werden.
Auch die Masse der Sequenzen kann durch den Vergleich mit RNA-Molekülen definierter Größe (z.B. Ribosomal-RNA) erschlossen werden. Diese werden als Molekülmassen-Standard während der Gelelektrophorese verwendet.
