Forschung

Calcium-Calmodulin als Regulator des passiven Calciumausstroms aus dem ER

Seit vielen Jahren ist das Phänomen des passiven Ca²⁺-Ausstroms aus dem ER bekannt, dem die ER-ständigen Ca²⁺-ATPase (SERCA) entgegenarbeitet, um die Ca²⁺-abhängigen Signalwege regulierbar und die Zellen am Leben zu halten. Erst im Lauf der letzten Jahre wurden jedoch erste Proteine als für diesen Ca²⁺-Ausstrom aus dem ER verantwortlich charakterisiert. Darüber hinaus wurde in den letzten Jahren von verschiedenen Arbeitsgruppen eine Reihe von indirekten Hinweisen dafür gewonnen, dass es sich beim Sec61-Komplex um einen weiteren Ca²⁺-Ausstromkanal handeln könnte. So wurde an einzelnen Zellen gezeigt, dass die artifizielle Freisetzung naszierender Polypeptidketten von Ribosomen und damit auch ER-gebundenen Ribosomen durch Puromycin zu einer Erniedrigung der ER-luminalen Ca²⁺-Konzentration führt, die man direkt sichtbar machen kann bzw. indirekt entweder an einer Induktion des Stim1- und Orai1-abhängigen „store-operated calcium entry“ (SOCE) oder an einer Reduktion der durch Thapsigargin induzierbaren Ca²⁺-Freisetzung in das Cytosol erkennen kann. Zuletzt konnten die Arbeitsgruppen Cavalié (Experimental and Clinical Pharmacology and Toxicology, Homburg) & Zimmermann in Kooperation zeigen, dass die Inaktivierung des SEC61A1-Gens mittels siRNA in HeLa-Zellen mit einer Reduktion des Ca²⁺-Ausstroms aus dem ER einhergeht und somit den ersten direkten Hinweis auf den Sec61-Komplex als Ca²⁺-Ausstromkanal erarbeiten. In diesem Zusammenhang sehen wir unsere neuen Befunde im Rahmen der Zusammenarbeit der Arbeitsgruppen von Wagner (Biophysik, Universität Osnabrück) & Zimmermann, nach denen Ca²⁺-Calmodulin den Sec61-Komplex gegenüber Ionen abdichten und an ein IQ-Motif im cytosolischen Aminoterminus der a-Untereinheit des Sec61-Komplexes binden kann. Unsere Arbeiten deuten auch daraufhin, dass die Bindung von Ca²⁺-CaM an den Sec61-Komplex den Ca²⁺-Ausstrom aus dem ER unterdrücken kann ohne dabei den Proteintransport zu behindern. Die Schlüsselergebnisse auf zellulärer Ebene bestanden darin, dass zwei verschiedene CaM-Antagonisten (Ophiobolin A und Trifluoperazin) den Thapsigargin induzierbaren Ca²⁺-Ausstrom in HeLa-Zellen verstärken und dass dieser Effekt durch Silencing des SEC61A1-Gens mit zwei verschiedenen SEC61A1-spezifischen siRNAs unterdrückt wird. Der Effekt der siRNA konnte durch Expression der SEC61A1 cDNA aufgehoben werden. Diese Befunde werden durch die Beobachtung gestützt, dass die beiden CaM-Antagonisten den Thapsigargin-induzierten SOCE verstärkten.

Daraus schließen wir, dass die Rolle des CaM unter physiologischen Bedingungen vermutlich darin besteht, in Abhängigkeit von Ca²⁺ eine Konformationsänderung im Sec61-Komplex zu induzieren, die den Ca²⁺-Ausstrom behindert. Der ultimative Beweis für unsere Sichtweise wurde in Calcium-Imagingexperimenten erbracht, in denen SEC61A1-UTR siRNA und ein SEC61-IRES-GFP-Plasmid, das für eine IQ-Doppelmutante von Sec61a kodiert in An- und Abwesenheit der Calmodulinantagonisten zum Einsatz kamen. Der Effekt der siRNA konnte durch Expression der SEC61A1 cDNA mit Mutation des IQ-Motifs nicht aufgehoben werden. Die Interpretation dieser Ergebnisse wird durch Dockinganalyse und molekulares Modellieren von Komplexen aus Ca²⁺-CaM, Ribosom und humanem Sec61-Komplex unterstützt, die von der Arbeitsgruppe Helms (Computational Biology, Saarbrücken) durchgeführt wurden. Danach sollte Ca²⁺-CaM selbst in Anwesenheit von Ribosomen an das IQ-Motif der a-Untereinheit des Sec61-Komplexes binden können (Ribosom in Blau, Sec61-Komplex in drei Rottönen für die drei Untereinheiten, IQ-Motif in der a-Untereinehit in gelb, Phospholipidkopfgruppen in grau).

Film 3:

3D-Struktur des Komplexes aus einem Ribosom und einem heterotrimeren Sec61-Komplex

Film 4:

Docking von Calcium-Calmodulin an den Komplex aus Ribosom und Sec61-Komplex

Literatur

Erdmann, F., Schäuble, N., Lang, S., Jung, M., Honigmann, A., Ahmad, M., Benedix, J., Dudek, J., Kopp, A., Helms, V., Cavalié, A., Wagner, R. und Zimmermann, R. (2011) "Interaction of calmodulin with Sec61a limits Ca²⁺ leakage from the endoplasmic reticulum",EMBO J. 30, 17-31.

Zimmermann, R., Eyrisch, S., Ahmad, M. und Helms, V. (2011) "Protein translocation across the ER membrane", Biochim. Biophys. Acta 1808, 912-924.