Definition

5. Vorgehensweise und benötigte Strukturen für einen klassischen ELISA-Test

5.1 Vorgehensweise

1. Ein Antigen wird an eine Mikrotiterplatte angeheftet.
2. Der gesuchte primäre Antikörper in einer Probe bindet sich an das Antigen, das an der Mikrotiterplatte gebunden ist.
3. Ein sekundärer enzymmarkierter Detektionsantikörper koppelt sich an den gesuchten primären Antikörper. (Dieser Schritt wird übersprungen, falls der primäre Antikörper schon enzymmarkiert ist. In diesem Fall spricht man von einem direkten ELISA).
4. Das Enzym wandelt farbloses Substrat in einen Farbstoff um.
5. Die Intensität der Farbe zeigt an, wie viele der gesuchten Antikörper in der Probe sind.
6. Die quantitative Bestimmung der Antikörper ist letztendlich durch den Einsatz eines Spektrophotometers kolorimetrisch möglich. Hierbei wird die Farbmenge in jedem Probengefäß (Well) mit Hilfe des Spektrophotometers gemessen und mit einer Verdünnungsreihe bekannter Konzentrationen (Standardreihe) verglichen.[1]

Abb. 2: Prinzip des direkten (links) und des indirekten (rechts) ELISAs[2]

Abb.3: Schematische Darstellung der Vorgehensweise bei einem indirekten ELISA-Test[3]

5.2 Benötigte Strukturen

5.2.1 Verwendete Enzyme im ELISA

Enzyme bestehen meist aus Proteinen und fungieren als Biokatalysatoren. Sie lassen chemische Reaktionen durch Verringern der Aktivierungsenergie beschleunigt ablaufen. Enzyme weisen ihrerseits ebenfalls eine hohe Spezifität auf, sie wirken gleichermaßen nach dem Schlüssel-Schloss-Prinzip. Dies bedeutet, dass Enzyme nicht jede chemische Reaktion katalysieren, sondern „nur ein ganz bestimmtes Substrat (Substratspezifität) [erkennen]“[4] und dieses zu einem bestimmten Produkt umwandeln (Wirkungsspezifität).

Antikörper werden im Verfahren mit sogenannten Reporterenzymen markiert. Diese Reporterenzyme setzen ein zuvor zugegebenes farbloses Substrat in der Probe um. Dadurch entstehen Farbumschläge bzw. Chemolumineszenzen, anhand deren Intensität man messen kann, ob und wie viel der gesuchten Verbindung in der Probe vorhanden ist.

Beispiele für Reporterenzyme sind: Alkalische Phosphatase (AP), Meerrettichperoxidase (HRP, horseradish peroxidase), Glucose-Oxidase.

Veranschaulichung am Beispiel des Enzyms Alkalische Phosphatase:

Es wird farbloses pNPP (p-Nitrophenylphosphat) als Farbstoffsubstrat hinzugegeben. Das Enzym Alkalische Phosphatase spaltet den Phosphatrest vom farblosen pNPP ab (Hydrolyse). Dabei entsteht schwach gelbes, lösliches p-Nitrophenol als Endprodukt.[5]

Abb.4: Alkalische Phosphatase[6]

Abb.5: Farbreaktion der alkalischen Phosphatase mit pNPP[7]

5.2.2 Verwendete Substrate

Unter dem Begriff Substrat versteht man in der Enzymatik den Ausgangsstoff (=Edukt) einer enzymatisch-beschleunigten, biochemischen Reaktion.

Eine solche Reaktion lässt sich vereinfacht folgendermaßen darstellen:

A  +  Enzym   →   B  +  Enzym

Das Edukt A nennt man in dieser Reaktionsgleichung Substrat des Enzyms. Das Produkt B wird als umgewandeltes bzw. umgesetztes Substrat bezeichnet.

Im ELISA-Test werden bevorzugt chromogene und fluorogene Substrate verwendet. Durch die enzymatische Spaltung eines solchen Substrats „wird ein Chromogen (Farbstoff), bzw. ein Fluorogen (Fluoreszenzfarbstoff) freigesetzt […] Mittels der Intensität der Färbung oder Fluoreszenz kann [nun] die enzymatische Aktivität“[8] nachgewiesen werden.

Zusammenfassend lässt sich also sagen, dass Substrate (Chromogene) während des Tests zugefügt werden, damit die Enzyme diese chemisch umsetzen und so entweder Farbwechsel oder Lumineszenzen entstehen, die man messen kann. Mit Hilfe der Intensität der Farbe wird so die Quantität der markierten Antikörper bestimmt.[9]

Arten von verwendeten Substraten für die AP bzw. HRP:

1. Kolorimetrische Substrate:

Sie sind die am häufigsten verwendeten Substrate, da sie einen sichtbaren Endpunkt durch Farbwechsel erzeugen. Zudem sind sie robust und lange stabil.

Bsp:. 3,3,3‘,5,5‘-Tetramethylbenzidin (TMB), p-Nitrophenylphosphat (pNPP)

2. Fluoreszente Substrate

Sie können ein stärkeres Signal und einen breiteren dynamischen Bereich erreichen. Ein fluoreszentes Substrat hat aber eine kürzere Halbwertszeit als ein kolorimetrisches, das heißt das Signal lässt mit der Zeit nach.

Bsp.: 10-Acetyl-3,7-Dihydroxyphenoxazin

3. Chemilumineszente Substrate

Sie können einen breiteren dynamischen Bereich abdecken und haben ein niedrigeres Hintergrundsignal, das heißt insgesamt eine höhere Sensitivität.

AP oder HRP oxidieren in Anwesenheit des Substrats Peroxid Luminol und es wird Licht im Bereich von 425 nm emittiert.[10]

5.2.3 Eingesetzte Puffer

Puffer nennt man „Lösungen aus einer schwachen Säure/Base und ihrer korrespondierenden Base/Säure (Salz). [Sie] werden eingesetzt, um in einem begrenzten Maß den pH-Wert konstant zu halten“[11].

Mit Hilfe der Pufferlösungen werden also „die chemischen Bedingungen, die in einer Zelle herrschen, für ein im Reagenzglas eingesetztes Enzym“[12] nachgeahmt.  Da jedes einzelne Enzym ein spezifisches pH-Optimum besitzt, in dem es optimal operieren kann, ist der pH-Wert maßgebend für das Stattfinden aller enzym-katalysierten biochemischen Reaktionen. Aufgrund dessen ist es obligatorisch, jeder zu untersuchenden Probe eine geeignete Pufferlösung hinzuzufügen, um so eine bestmögliche Wirkungsweise der Enzyme zu gewährleisten.

Für einen ELISA werden für verschiedene Schritte verschiedene Puffer benötigt:

1. Beschichtungspuffer: fördern die Adsorption von Antigen und Antikörper an die Well-Oberfläche. Sie sollten keine Proteine enthalten, die mit der Bindung von Antikörpern oder Antigenen an die Oberfläche konkurrieren könnten.

Bsp: PBS (Phosphate-Buffered Saline), Natriumbicarbonat etc.

2.   Blockierungspuffer: verhindert unspezifische Bindung des Nachweisantikörpers an die Oberfläche des Wells. Enthält entweder Proteine zum Blockieren von Bindungsstellen oder Detergenzien, die Bindung verhindern.

3.   Waschpuffer: wird zwischen den einzelnen Schritten des Tests verwendet, um jegliches ungebundenes Material zu entfernen.

4.   Nachweispuffer: enthält das für den Antikörper-Enzym-Komplex benötigte Substrat.[13]