Anwendungsbeispiele
Die Blotting-Techniken werden sowohl in der Forschung, als auch in der Labordiagnostik angewendet. Im Nachfolgenden werden Anwendungsgebiete der verschiedenen Blotting-Verfahren kurz erläutert.
Southern Blotting
Mit Hilfe des Southern-Blottings können Veränderungen in der DNA festgestellt werden. Klinisch relevant ist dies beispielsweise bei der Bewertung von genetischen Defekten, die unter Umständen eine große Auswirkung auf die Gesundheit des Lebewesens haben. So können unter Anderem Expansionen in der Nukleotid-Abfolge der DNA festgestellt werden, durch die die Synthetisierung der Proteine im Körper schwer gestört sein kann. Vor allem einige vererbbare Erkrankungen beruhen auf genau diesem Fehler in der DNA. Die Folge ist die Bildung von fehlerhaften oder funktionslosen Proteinen.
In den letzten Jahren hat die Southern-Blot-Analyse im klinisch diagnostischen Bereich einen Bedeutungsverlust erlitten und wurde vermehrt durch die PCR (Polymerase-Kettenreaktion) ersetzt. Der Southern-Blot wird daher nur noch selten in der Diagnostik verwendet, wie z.B. zur direkten Genotypdiagnostik bei Fragilen-X-Syndrom.
Western Blotting
Die Western-Technik (Immunblot) ermöglicht die Analyse sowohl von Proteingemischen, als auch von einzelnen Proteinen bezüglich ihrer Qualität und ihrer Menge.
„Im Bereich der Proteinbiochemie dient der Western Blot zum Nachweis von bestimmten Proteinen und Protein-Veränderungen, z.B. Phosphorylierung. Es kann auch eine semiquantitative Analyse durchgeführt werden (Probe A enthält mehr Protein X als Probe B).
Im Bereich der Medizin dient das Western Blotting dem Nachweis diagnostisch interessanter Proteine, so zum Beispiel von Antikörpern im Serum, welche für das Vorliegen bestimmter Infektionskrankheiten typisch sein können. Mittels des Western Blot kann man Antikörper gegen Viren oder andere Erreger im Serum nachzuweisen (z.B. Hepatitis B, Hepatitis C, HIV, Syphilis) oder den Direktnachweis von krankheitsrelevanten Proteinen erbringen (z.B. HIV p24-Antigen)“.
Insbesondere in der HIV-Diagnostik dient der Western-Blot als Bestätigungstest zum Antikörpernachweis, um die geringe Spezifität des Suchtests (enzymelinked immunosorbent assay, ELISA) auszugleichen.
Der Western-Blot ist für die Serum-Diagnostik bei Patienten von großer Bedeutung. Durch das Fixieren bestimmter Marker auf einem Streifen, wird eine effektive Methode zur Diagnostik von vielen Erkrankungen entwickelt. Nutzen kann man dies zum Beispiel als Teststreifen zur Bestimmung vorliegender Allergien: Mittels Western Blot werden Allergene auf einem Teststreifen fixiert. Kommen diese Allergene mit Blut in Kontakt, das Antikörper gegen diese Allergene enthält, werden diese an das Allergen anknüpfen und die Linie auf dem Teststreifen stellt sich dar (Allergy Line Blots). Ein Beispiel finden Sie in der nebenstehenden Abbildung.
Ein weiteres, praktisches Beispiel einer Western-Blot-Umsetzung per Teststreifen findet sich in solchen zum Nachweis von bestimmten Borrelia. Auf den Teststreifen finden sich die elektrophoretisch aufgetrennten Antigen- Extrakte. Bei Kontakt mit positiven Proben binden sich die nachzuweisenden Antikörper an die membrangebundenen Antigene. Nach einer Farbreaktion erscheinen dunkle Linien an den zutreffenden Antigen-Positionen. Mit Hilfe einer Kontrollbande wird sichergestellt, dass der Test seine korrekte Funktion erfüllt hat und keine Fehler aufgetreten sind.
Genau wie im Beispiel zuvor sehen wir hier ebenfalls eine Umsetzung des Western Blot als sogenannten “Line Blot”, also einer Kombinationsform. Auch hierzu finden Sie zwei passende Abbildungen.
Hierbei handelt es sich um Teststreifen, die vom jeweiligen Serum durchflossen werden und so die Antigen-Antikörper-Komplexe sichtbar machen.
northern Blotting
Der northern-Blot ist eine zum Southern-Blot analoge Methode zur Analyse von RNA. Diese Methode wird überwiegend zu Forschungszwecken genutzt um beispielsweise mittels Nachweis von mRNA die Genexpression zu erforschen. Bei dem Nachweis von mRNA kann erforscht werden, ob bestimmte Gene derzeit von den untersuchten Zellen genutzt werden um Proteine zu bilden (entsprechende RNA vorhanden), oder ob die Gene derzeit nicht exprimiert werden (entspechende RNA nicht vorhanden). (Beispiel Studie der Universität Göttingen: “Untersuchungen zur Expression, Funktion und Regulation ausgewählter Gene der Insulinfamilie”)
Die RNA-Proben können ebenfalls auf ihre Vollständigkeit und auf Fehler sowie Degradierungen untersucht werden, wie z.B. Fehler beim Spleißen. Solche Fehler führen zu Erkrankungen, deren Ursache Proteine sind, die durch das Fehlen der fehlerhaft gespleißten Abschnitte nicht korrekt exprimiert werden können. Bestimmte Spleißmutationen lassen sich auch bei Patienten mit Mukoviszidose finden.
eastern Blotting
Da das eastern Blotting stark mit dem western Blotting verwandt ist, findet sie in der klinischen, bzw. diagnostischen Nutzung wenig Anwendung. Meist gibt es mehrere Alternativen, die die Nutzung von eastern Blotting überflüssig, oder zu aufwendig erscheinen lassen.
Sonstige Formen / Kombinationen
„Da Proteine nicht nur mit Antikörpern, sondern auch mit anderen Molekülen wechselwirken können, hat das western-Blotting vielfältige Ergänzungen erfahren.“ Daraus kann man ableiten, dass es Kombinationen der oben einzeln aufgeführten Verfahren gibt. So werden die hierbei eingesetzten Prinzipien in modifizierter Weise zur Untersuchung von Protein-RNA-Interaktionen (north-western-Technik; RNA-bindende Proteine) oder Protein- DNA-Ineraktionen (South-western-Technik, Transkriptionsfaktoren) herangezogen.
In einer zur South-western-Technik analogen Weise können mit der north-western-Technik Protein-RNA-Interaktionen untersucht werden. Hierdurch können Proteine untersucht werden, die mit RNA interagieren, wie z.B. Faktoren, die an der Translationskontrolle beteiligt sind.
Zur Analyse von Wechselwirkungen zwischen Proteinen (Protein-Protein-Interaktionen) kann eine weitere Abwandlung der western-Technik, die sogenannte Far-western-Technik, herangezogen werden.
Eine weitere Abwandlung der western-Technik stellt die Shift-western-Technik zur Analyse DNA-bindender Proteine dar. Hierbei wird beispielsweise der Transfer von Bakterien oder Phagen bei der Suche nach bestimmten Genen oder DNA-Abschnitten in Genbibliotheken (Genbanken) durchgeführt.
Doppelblotting
Diese Methode dient der Antidoping-Kontrolle im Humanurin.
Treten beim western Blotting in sehr komplexen Proben (bspw. Humanurin), sehr starke unspezifische Wechselwirkungen von Sekundärantikörpern mit eigenen Probenproteinen (z.B. Urinproteinen) auf, wird hier ein zweiter Transferabschnitt durchgeführt.
DigiWest Blotting
Das DigiWest ist ein automatisches Analysesystem, welches dazu dient parallel viele unterschiedliche Proteine von sehr kleinem Probenmaterial zu bestimmen.
Diese Methode ermöglicht umfangreiche Analysen von limitierten Probenmengen, (wie z.B. von mittels Lasermikrodissektion gewonnen Zellen). Des Weiteren ermöglicht sie die Auswertung der Western-Blotting-Methode zu Proteomik-Größenordnungen. Dabei erlaubt die Empfindlichkeit, die Kombination von Molekülgrößeninformation und die Linearität des Signals auf einer automatisierten Plattform die gleichzeitige Quantifizierung hunderter spezifischer Proteine und Proteinmodifizierungen auf einmal.
Fazit: Wozu das Ganze?
Die verschiedenen Blotting Techniken dienen der Untersuchung von DNA, RNA oder Proteinen. Diese Techniken gehören zum Standard vieler Untersuchungsverfahren der Forschung, vor allem das western Blot hat aber auch tägliche Anwendungen in der klinischen Medizin im Rahmen der Virusdiagnostik und Autoimmundiagnostik.
Sicherlich findet das Blotting in der Medizin eine Anwendung. Insbesondere der western-Blot hat einen hohen Stellenwert in der Detektion von Antikörpern, wie beispielsweise im beschriebenen Allergie- oder Borellia-Test. Ohne das Blotting, wäre eine Fixierung der Antigene und anderer Marker schwer auf einen Teststreifen umsetzbar.
Auch im Nachweis bestimmter Erreger hat insbesondere das western Blotting eine große Relevanz in der Medizin.
