DNA-Reparatur im Kontext des Chromatins
Die Reparatur von DNA Doppelstrangbrüchen im Kontext des Chromatins
Die lokale Chromatinstruktur besitzt eine essentielle Bedeutung für die Erkennung und Prozessierung von DNA Schäden. Im Rahmen einer DNA Schädigung führen lokale Modifikationen zu einer räumlichen Umstrukturierung des Chromatins, wobei diese Chromatin-Relaxation erst den Zugang der verschiedenen Reparaturproteine zur DNA Läsion ermöglicht. Aufgrund der extremen Kondensierung erscheint insbesondere das Heterochromatin als strukturelle Barriere für die Detektion und Prozessierung von DSBs. Durch ein komplexes Zusammenspiel von Chromatin-modifizierenden Faktoren wird die Chromatinstruktur aufgelockert bzw. geöffnet, so dass die einzelnen DNA Reparaturmechanismen ablaufen können. Eine entscheidende Herausforderung wird sein, die genauen molekularen Zusammenhänge zwischen der vorliegenden Chromatinstruktur, den erforderlichen Chromatin-Modifikationen und den einzelnen DNA Reparaturprozessen hinsichtlich ihrer zeitlichen und räumlichen Koordination herauszuarbeiten. In den letzten Jahren etablierten wir in unserem Labor die hochauflösende Transmissions-Elektronenmikroskopie (TEM), um Immunogold-markierte DNA Reparaturproteine in der intakten Ultrastruktur des Zellkerns untersuchen zu können. Aufgrund der erheblich höheren Auflösung dieses TEM-Verfahrens sind im Vergleich zur Immunfluoreszenz-Mikroskopie (IFM) weitaus präzisere Analysen hinsichtlich der Prozessierung von DNA-Schäden möglich. So können die zentralen Reparaturproteine des NHEJ wie beispielsweise das Ku70-Ku80 Heterodimer und die DNA-PKcs, die am Bruch in so geringer Anzahl vorliegen, dass sie keine fluoreszenz-mikroskopisch sichtbaren Foci ausbilden, nach einer Immunogold-Markierung mit Hilfe der TEM nachgewiesen werden. Darüber hinaus ermöglicht die TEM eine klare Differenzierung zwischen dicht-gepacktem Heterochromatin und locker-gepacktem Euchromatin. Auch kann die Chromatinstruktur durch spezifische Histonmodifikationen zusätzlich charakterisiert werden. Hierdurch können die molekularen Zusammenhänge zwischen den verschiedenen Reparaturproteinen und spezifischen Histonmodifikation funktionell charakterisiert werden. Insgesamt steht hiermit eine innovative, ultrasensitive Methode zur Verfügung, um die Mechanismen der DNA-Schadensantwort und insbesondere der DSB-Reparatur im Kontext des Chromatins zu untersuchen.
Forschungsförderung durch:
Publikationen:
Focused ion microbeam irradiation induces clustering of DNA double-strand breaks in heterochromatin visualized by nanoscale-resolution electron microscopy. Lorat Y, Reindl J, Isermann A, Rübe C, Friedl A, Rübe CE. Int J Mol Sci. 2021,doi: 10.3390/ijms22147638 PMID: 34299263
Assessment of DNA damage by 53PB1 and pKu70 detection in peripheral blood lymphocytes by immunofluorescence and high-resolution transmission electron microscopy. Lorat Y, Fleckenstein J, Görlinger P, Rübe C, Rübe CE. Strahlenther Onkol. 2020 Sep;196(9):821-833. PMID: 32006067
Prevention of DNA Replication Stress by CHK1 Leads to Chemoresistance Despite a DNA Repair Defect in Homologous Recombination in Breast Cancer. Meyer F, Becker S, Classen S, Parplys AC, Mansour WY, Riepen B, Timm S, Ruebe C, Jasin M, Wikman H, Petersen C, Rothkamm K, Borgmann K. Cells. 2020 Jan 17;9(1):238. PMID: 31963582
Clustered DNA damage concentrated in particle trajectories causes persistent large-scale rearrangements in chromatin architecture. Timm S, Lorat Y, Jakob B, Taucher-Scholz G, Rübe CE. Radiother Oncol. 2018 Dec;129(3):600-610. Radiother Oncol. 2018. PMID: 30049456
Clustered double-strand breaks in heterochromatin perturb DNA repair after high linear energy transfer irradiation. Lorat Y, Timm S, Jakob B, Taucher-Scholz G, Rübe CE. Radiother Oncol. 2016 Oct;121(1):154-161. PMID: 27637859
Nanoscale analysis of clustered DNA damage after high-LET irradiation by quantitative electron microscopy--the heavy burden to repair. Lorat Y, Brunner CU, Schanz S, Jakob B, Taucher-Scholz G, Rübe CE. DNA Repair (Amst). 2015 Apr;28:93-106. PMID: 25659339
Beyond repair foci: DNA double-strand break repair in euchromatic and heterochromatic compartments analyzed by transmission electron microscopy. Lorat Y, Schanz S, Schuler N, Wennemuth G, Rübe C, Rübe CE. PLoS One. 2012;7(5):e38165. PMID: 22666473
DNA repair in the context of chromatin: new molecular insights by the nanoscale detection of DNA repair complexes using transmission electron microscopy. Rübe CE, Lorat Y, Schuler N, Schanz S, Wennemuth G, Rübe C. DNA Repair (Amst). 2011 Apr 3;10(4):427-37. PMID: 21342792
