Universitätsklinikum des Saarlandes und Medizinische Fakultät der Universität des Saarlandes
Klinik für Innere Medizin II - Gastroenterologie und Endokrinologie
Leitung: Univ.-Prof. Dr. Frank Lammert
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DFG

Identification and characterisation of complement factor C5 as quantitative trait gene that modifies liver fibrogenesis in mono- and polygenic mouse models (SFB/TRR 57)

Progressive liver fibrosis as the common consequence of all chronic liver diseases is a major medical and economic challenge, since there are no effective treatment options except liver transplantation. Environmental and host (genetic) factors contribute to variable fibrosis progression rate among individual patients, albeit the genetic factors that modify liver fibrogenesis have yet to be defined. This project focuses on the gene encoding complement factor C5, which we identified as fibrosis risk factor in previous genome scans in experimental crosses of inbred mouse strains (Nat Genet 2005;37:835-843), thus representing a potential molecular target for therapeutic interventions. The molecular mechanisms underlying the fibrogenic effects of C5 are dissected in transgenic mouse models generated using recombined bacterial artificial chromosomes. These mice overexpress C5 or show specific deletions of the receptors C5R1 or C5L2. As complementary approach, the antifibrotic effects of new intervention strategies (peptidomimetic receptor antagonists) are assessed during the activation of isolated primary hepatic stellate cells in vitro and during liver fibrogenesis in vivo. Furthermore, we analyze the role of C5 in a novel congenic mouse model of non-toxic (spontaneous) liver fibrogenesis (BALB-Abcb4-/-) and study anti-C5 strategies in this experimental framework. The results of this project might not only be relevant for patients with rapid progression of liver fibrosis (e.g. after liver transplantation) but for fibroproliferative diseases in other organs and the development of antifibrotic therapies in general.

 

Modulators of hepatic response to TGF-ß mediated cellular injury in inbred mice: Identification of modifiers of fibrosis susceptibility (DFG LA997/5-1)

Hepatic fibrosis is a non-specific response to chronic liver injury, the two most common causes being viral hepatitis or alcohol abuse. Twin studies and ethnic differences indicate that genetic factors play a role in predisposition to and progression of both types. In contrast to viral hepatitis, no firm associations between genetic variants and susceptibility to alcoholic liver fibrosis have been identified to date. Transforming growth factor (TGF)-β is considered the master pro-fibrogenic cytokine, driving fibrosis in response to various modes of injury. This central role makes every modifier locus of the response to TGF-β mediated hepatic injury a candidate gene for fibrosis susceptibility. The aim of this project is to identify the modifier genes of TGF-β mediated injury, using hepatocytes isolated from genetically distinct inbred mouse strains. Hepatocytes are highly responsive to TGF-β. Their demise leads to activation of Kupffer cells and subsequent release of inflammatory cytokines as well as activation of hepatic stellate cells with enhanced expression of growth factors and extracellular matrix components. Here, we propose to avail of a genetic reference population generated from progeny of inbred mouse lines C57BL/6J and DBA/2J, also known as BXD recombinant inbred lines. The genetically distinct hepatocytes from these mouse lines will be challenged with TGF-β, and phenotypic differences (cellular damage, gene expression) will be quantified to delineate differences in response. Quantitative trait locus mapping, i.e. linkage analysis in the BXD panel, will enable us to identify the genetic loci that underlie differential responses to TGF-β by allelic variation. This experimental framework will allow us to assess the orthologous human regions and candidate genes for contribution to fibrogenesis susceptibility in defined human cohorts.

 

Identifizierung und Charakterisierung von zellulären Mechanismen und genetischen Determinanten der kardialen und systemischen Fibrogenese (DFG LA997/6-1)

Eine abnorme und exzessive Ablagerung extrazellulärer Matrix (Fibrose) tritt als Reaktionsmuster auf chronische Organschädigungen auf. Hierbei weisen die kardiale und andere Organfibrosen sowohl gemeinsame als auch spezifische zelluläre Mechanismen und genetische Determinanten auf. Die perivaskuläre und/oder interstitielle Fibrose des Myokards spielt eine zentrale Rolle bei ventrikulärem und atrialem Remodeling und ist für die morphologische und funktionelle Pathogenese bei Myokardhypertrophie, Herzinsuffizienz und Vorhofflimmern entscheidend. Multiple Mediatoren und Signalwege sind bekannt, die bei kardialen, aber auch anderen Fibroseprozessen die Proliferation und die Aktivierung von Fibroblasten beeinflussen oder die Kollagensynthese stimulieren. Die zelluläre Regulation der kardialen Fibrogenese ist jedoch bisher nur teilweise verstanden. Weiterhin ist bislang nicht ausreichend untersucht, welche genetischen Faktoren (quantitative trait loci, QTL) die individuell variable Progression der Fibrose determinieren.

Unsere Studienhypothese ist, dass herzspezifische und systemische Fibrogenese sowohl gemeinsame als auch spezifische zelluläre Mechanismen und genetische Determinanten aufweisen, deren Charakterisierung die Grundlage für neue therapeutische Ansatzpunkte liefern kann. Wir werden deshalb verschiedene kardiale Fibrosemodelle qualitativ und quantitativ charakterisieren und die Beteiligung von zirkulierenden Fibrozyten aus dem Knochenmark vergleichend bei der kardialen und hepatischen Fibrose untersuchen. Zudem sollen die zentralen profibrogenen Signalwege durch eine simultane QTL-Analyse der kardialen und hepatischen Fibrogenese in rekombinanten Mausinzuchtlinien identifiziert werden.

 

Inflammatory microRNAs in liver cancer (DFG LA 997/7-1)

Chronic inflammation is one of the hallmarks of cancer. Hepatocellular carcinoma (HCC), responsible for > 0.5 million deaths worldwide per annum, is closely related to chronic inflammation, commonly caused by hepatitis B or C virus infections or steatohepatitis. Interleukin-6, an inflammatory cytokine, which signals via Jak/STAT3, often shows increased activity in HCC. In addition, expression levels of certain miRNAs (small non-coding RNAs, which negatively regulate gene expression) are also altered in HCC and other cancers.

Here, we aim to investigate the role of miRNAs in the regulation of IL-6/Jak/STAT3 signalling in hepatoma cells and non-transformed hepatocytes. We will not only study intracellular miRNAs, but will pay special attention to secreted miRNAs, isolated from blood samples. Potential targets of selected miRNAs shall be identified by detailed analysis and validation of corresponding mRNA expression data. In an independent approach, we will study miRNAs targeting key players of the IL-6 signal transduction cascade (e.g. STAT3, SOCS3). Results obtained with cell lines will be translated to samples from HCC patients (blood, tumour tissue, surrounding liver tissue) and to primary hepatocytes isolated from these patients.

The project will increase our knowledge on the relevance of intracellular and secreted miRNAs in inflammatory signal transduction. We expect moreover that our approach will lead to the identification of (a) miRNAs, which could be targeted therapeutically to modulate IL- 6/STAT3 signal transduction and (b) miRNAs, which may be eventually used as biomarkers in the diagnosis and prognosis of HCC. This would be most useful in the surveillance of risk patients with chronic hepatitis or liver cirrhosis to better predict potential progression into HCC at an early stage when treatment success rates are still favourable.


Covered transjugular intrahepatic portosystemic stent shunt versus optimezed medical treatment for the secondary prevention of variceal bleeding in cirrhosis (DFG SA388/4-1)

Patients with liver cirrhosis frequently develop dilated venous collaterals in the esophagus, i.e. esophageal varices. Bleeding from such varices is one of the major causes of death in these patients. After an initial hemorrhage, rebleeding is frequent (70 - 80 %). Thus, rebleeding prophylaxis is mandatory. Each of the current therapeutic options for these patients (endoscopic ligation of varices, drug treatment aimed at lowering the blood pressure inside the varices, and the insertion of a decompressive uncovered metal stent between the hepatic vein and a branch of the portal vein (TIPS)) carries major disadvantages. The present randomized, controlled, multicenter trial compares two regimens for rebleeding prophylaxis: the insertion of a newly developed, covered TIPS-stent (group A) and a hemodynamically monitored optimized medical treatment (drug treatment with propranolol plus isosorbide-5-mononitrate which will be replaced by endoscopic ligation of varices in case of an insufficient reduction of the portal pressure) (group B). Presumably, a small diameter covered TIPS induces sufficient portal pressure reduction for rebleeding prevention, but carries a much lower risk of typical problems after TIPS insertion (liver failure, hepatic encephalopathy, TIPS dysfunction). Page 4 of 14 This study evaluates the hypothesis that these advantages translate into a lower rebleeding rate (primary endpoint) when compared with optimized standard treatment.

 

Neuartige massenspektrometrische Methoden für die Bestimmung metabolischer Vitamin D-Marker (DFG VO1355/5-1)

Vitamin D beschreibt eine Gruppe von Secosteroiden, von denen Vitamin D2 und D3 die wichtigsten bioaktiven Vertreter sind. Vitamin D-Mangel spielt eine wichtige Rolle bei Knochenerkrankungen, wird aber zunehmend auch mit anderen Krankheiten wie z.B. Krebs und chronischen Lebererkrankungen in Verbindung gebracht. Für die Bestimmung von Vitamin D gibt es zahlreiche klinische Assays, die aber im Hinblick auf Empfindlichkeit und Genauigkeit erhebliche Schwächen aufweisen. Heute setzt man daher zunehmend LC-MS/MS-Methoden ein, da diese Techniken zum einen unterschiedliche Vitamin D-Spezies unterscheiden können, und zum anderen höherere Empfindlichkeit und Selektivität liefern. Die Methodenentwicklung erfordert jedoch erhebliche Erfahrung, um die zahlreichen Fehlermöglichkeiten und inherenten Schwächen der Technik auszugleichen. Das Ziel dieses Vorhabens ist daher die Entwicklung neuartiger Analysetechniken, die gezielt die wichtigsten Schwachstellen umgehen. Wir schlagen zwei komplementäre Ansätze vor: (1) Chemische Markierungswerkzeuge zur Erhöhung von Empfindlichkeit und Selektivität; (2) Anwendung der Differentiellen Ionenmobilitäts- und Massenspektrometrie (DMS-MS) zur Entfernung isobarer/isomerer Störungen. Wir erhoffen uns zudem Aussagen zum diagnostischen Potential metabolischer Fingerabdrücke aus Verlaufsmessungen einer klinischen Studie und Korrelationen mit dem Krankheitsphänotyp.Das erste Teilprojekt beschäftigt sich mit wichtigen Schwachstellen gegenwärtiger Vitamin D-Methoden, d.h. mangelnde Detektionsempfindlichkeit und Kalibrationsprobleme. Die geringe Empfindlichkeit beschränkt die meisten Methoden auf 25-Hydroxyvitamin D. Diagnostische Aussagen unter Berücksichtigung anderer Metaboliten sind daher nicht möglich. Wir werden im Rahmen dieses Vorhabens neuartige isotopenkodierte Markierungswerkzeuge für die LC-MS/MS entwickeln, mit denen sich z.B. zeitabhängige Veränderungen der Vitamin D-Metaboliten-Konzentration im Verlauf einer Supplementationsstudie erfassen oder verschiedene Krankheitszustände vergleichen lassen. Des weiteren werden wir metallkodierte Label unter Einsatz eines Chelat/Lanthanid-Komplexes entwickeln, die sich mit extrem hoher Empfindlichkeit durch ICP-MS messen lassen.Das zweite Teilprojekt untersucht die begrenzte Selektivität der LC-MS/MS, die durch unspezifische Störungen endogener Substanzen hervorgerufen wird, was zu systematischen Fehlern führen kann. Wir schlagen einen zusätzlichen Gasphasen-Trennschritt mit Hilfe der DMS vor. Die DMS erlaubt häufig die Trennung isobarer und isomerer Substanzen, da der Trennmechanismus kaum vom Masse-zu-Ladungsverhältnis, sondern eher von Konformation, Ladungszustand, etc. abhängt. Wir wollen die gekoppelte DMS-MS zur Entfernung koeluierender Interferenzen einsetzen, um damit Nachweisgrenzen zu verbessern und systematische Fehler zu vermeiden. Wir wollen auch untersuchen, ob sich DMS-MS für die Unterscheidung der C-3-Epimere eignet, um diese Spezies korrekt zu erfassen.