Saarland University Faculty of Medicine
Präparataufbereitung
Prof. Dr. Peter Lipp

Präparataufbereitung

 

Nukleinsäuren


Nukleinsäuren sind Bestandteile von Viren, Bakterien, menschlichen und pflanzlichen Zellen. Die folgenden Techniken finden sowohl bei der DNA- als auch bei der RNA-Analyse Anwendung. Je nach Spender und Art der Nukleinsäure gibt es präferierte Verfahren und Abweichungen für die angegebenen Substanzen.

 

Gewinnung der Nukleinsäuren

Als zellulärer Bestandteil werden Nukleinsäuren aus Zellverbänden oder Zellkulturen gewonnen. Der Homogenisator eröffnet mechanisch durch hochfrequent, rotierende Messer die Zellmembran/Zellwand. Chemisch kann ein Zellaufschluss durch eine aktive Protease K erfolgen. Dieser proteolytische Abbau stellt eine chemische Alternative zum mechanischen Zellaufschluss dar und findet häufig bei Exponaten mit Zellwänden Anwendung. Beiden Varianten des Zellaufschluss schließt sich das Schockfrosten an. Das Frosten generiert den Erhalt des zu untersuchenden Materials, das andernfalls durch zelluläre, enzymatische Prozesse abgebaut werden würde. Das vorliegende Homogenat aus zellulären Bestandteilen wird zentrifugiert und die zu analysierenden Bestandteile werden herausgefiltert.

 

Reinigung und Isolation der Nukleinsäuren

Das Ziel ist es, die Präparate in einen möglichst sauberen und kontaminierungsfreien Zustand zu überführen. Beispiele für mögliche Kontaminierungen der Nukleinsäuren sind Nukleasen, Makromoleküle, Salze und Nukleinsäuren anderer Art. Die Reinigung kann sowohl durch chemische als auch durch physikalische Prozesse erfolgen.

 

Chemische Isolation und Reinigung:

Phenolextraktion: Durch die Phenolextraktion werden die Präparate von proteinhaltigen Kontaminationen befreit. Um Schäden an den Nukleinsäuren zu verhindern, wird das Phenol zuvor gepuffert. Die Reinigung erfolgt durch Ausschüttlung der Nukleinsäurelösung. Phenol bewirkt eine Denaturierung der Proteine. Zunächst wird die organische Phenolphase mit der Nukleinsäurelösung vermischt. Durch Zentrifugation wird die im Anschluss von Natur aus eintretende Phasentrennung beschleunigt. Zwischen den Ausgangsphasen bildet sich nun eine weitere Phase; die Interphase. In dieser sammeln sich die denaturierten, ausgefallenen Proteine an. Dieser Phenolysierung wird wiederholt, bis keine Interphase mehr auftritt und die Nukleinsäurelösung somit vollständig deproteiniert ist.

 

Weitere chemische Verfahren der Reinigung und Isolation:

  • Gelfiltration
  • Ethanolpräzipitation

 

Physikalisch-chemische Isolation und Reinigung

Magnetic-beads-Methode

Sowohl Nukleinsäuren als auch andere biologische Materialien lassen sich durch die magnetic-beads-Methode isolieren und dadurch von Kontaminationen reinigen. Sie gilt daher als universell einsetzbar. 
Eingesetzt werden paramagnetische Teilchen, die in ihrer Beschichtung variieren. Diese richtet sich nach den Bindungseigenschaften der zu untersuchenden Präparate. Für DNA werden beispielsweise Silica-umhüllte beads verwendet, für RNA Streptavin-umhüllte beads. An die Beschichtung dieser sogenannten magnetic beads erfolgt eine reversible Bindung der Nukleinsäuren. Durch ein extern angelegtes Magnetfeld werden die Teilchen magnetisiert. Durch die Magnetisierung werden sowohl die magnetic beads als auch die an ihnen gebundenen Nukleinsäuren in einem Magnetfeld gehalten. Weitere Bestandteile des vorliegenden Präparats werden durch Auswaschung entfernt. Die Lösung der reversiblen Bindungen zwischen Nukleinsäure und bead erfolgt im Anschluss durch eine Erhöhung der Salz- oder Ladungskonzentration.

 

Behandlung mit Restriktionsenzymen

Je nach Ziel der Analyse ist der Reinigung und Isolation der Nukleinsäuren eine Behandlung mit Restriktionsenzymen angeschlossen. Diese Restriktionsenzyme spalten die Nukleinsäuren in Fragmente. Die Spaltung erfolgt aufgrund der Spaltspezifität der Nukleasen an bekannten Schnittstellen. Die Wahl der Nuklease beruht auf deren charakteristische Schnittstelle. Durch diese Methode kann die Nukleinsäure in eine definierte Anzahl von Fragmenten gespalten werden, die im Nachgang gelelektrophoretisch aufgetrennt werden können.

 

 

 

Proteine


Gewinnung von Proteinen

Extrazelluläre Proteine

Die Gewinnung von extrazellulären Proteinen erfolgt durch Zentrifugation. Der Prozess wird am Beispiel des Serumalbumins im Folgenden aufgezeigt. Das Albumin befindet sich gelöst im Blut. Das wird zunächst entnommen, um im Anschluss die zellulären Blutbestandteile durch Zentrifugation abzutrennen. Zurück bleibt das proteinhaltige Plasma.

 

Zytoplasmatische Proteine

Die Gewinnung von zytoplasmatischen Proteinen erfolgt durch den Zellaufschluss. Auch hier kann dieser mechanischer wie auch chemischer Natur sein (siehe Gewinnung von Nukleinsäuren). Zu beachten ist hierbei die Aggressivität und Spezifität des chemischen Aufschlussmittels. Die Detergenzien müssen Zellwände/Zellmembranen proteolytisch abbauen, ohne die zu untersuchenden Proteine zu beschädigen. Das Ziel ist es, Proteine in intaktem, nichtdenaturietem Zustand zu gewinnen. Um diesen Zustand zu generieren, werden zusätzlich Proteininhibitoren hinzugemischt, die eine enzymatische Modifikation der Proteine verhindert.
Auf die beiden Varianten des Zellaufschluss folgt die Reinigung und Isolierung der Proteine.

Zur Vereinfachung der Gewinnung wird im Voraus die Zelle behandelt. Das gewünschte Protein wird dabei entweder in den entsprechenden Kompartimenten angereichert oder störende Kontaminierungen reduziert.

 

Isolation und Reinigung von Proteinen

Das Ziel ist es, Proteine in einem möglichst reinen, beschädigendem Zustand zu extrahieren. Hauptsächliche Kontaminationen von Proteinen sind Nukleinsäuren, Polysaccharide, Salzionen und Lipide, die es gilt zu entfernen. In erster Linie wird die proteinhaltige, zelluläre Substanz zentrifugiert. Die Zentrifugation dient nicht nur der Filterung und Auftrennung. Zusätzlich sorgt der damit verbundene Auswaschungsprozess für eine irreversible Deaktivierung von präparatschädigenden Proteasen. Im Anschluss an die Zentrifugation wird das Filtrat in Lösung gebracht. Diese Lösung weist in diesem Status einen mangelnden Reinheitsgrad auf, weswegen weitere Reinigungsverfahren nachgeschaltet werden.

 

Affinitätschromatographie

Durch die Methode der Affinitätschromatografie können Proteine aus einer Lösung herausgetrennt werden. Dieses Isolationsverfahren beruht auf den spezifischen Bindungseigenschaften der zu untersuchenden Proteine. Als Ligand werden zum Beispiel Antikörper oder Substrate, bei denen eine Affinität der entsprechenden Proteine vorliegt, eingesetzt. Es erfolgt eine reversible Bindung der Proteine. Durch Auswaschung werden die Kontaminierungen, die nicht durch den eingesetzten Liganden gebunden wurden, entfernt. Die Elution der Proteine erfolgt durch eine Veränderung der eingesetzten Pufferzusammensetzung. Die Hinzugabe eines sauren Puffers bewirkt die Lösung der Protein-Ligand-Bindung. Das gewonnene Eluat enthält die isolierten, gereinigten Proteine.

 

Weitere Methoden zur Isolation von Proteinen aus einer Lösung:

  • Ionenaustauschchromatographie
  • Isoelektrische Fokussierung
  • Gelfiltration
  • Hydrophobe Interaktionschromatographie