Analyse der geblotteten Membran
Um letztendlich die geblottete Membran auslesen zu können, muss man die DNA, RNA oder das Protein, das man nachweisen möchte, sichtbar machen. Dies kann man zum Beispiel mit der Hybridisierung machen. Hierfür braucht man eine passende Sonde für die Sequenz, die man nachweisen möchte. Im Folgenden werde ich erklären wie dies funktioniert.
PCR-Methode
Um eine passende DNA-Sonde herzustellen, kann man die Polymerasekettenreaktion benutzen, kurz PCR. Hierbei wird eine DNA-Sequenz vervielfältigt.
Hierzu wird die zu vervielfältigende DNA-Sequenz in einem kleinen Plastik Behälter in den sogenannten Thermocycler gestellt. Dieses Gerät kontrolliert die Temperatur und kann sie konstant hoch oder niedrig halten und auch verändern.
Der erste Schritt ist die Denaturierung. Hierbei wird die DNA-Sequenz auf 94°C-96°C für 20-30 Sekunden erhitzt. Dabei lösen sich die Wasserstoffbrückenbindungen zwischen den Aminosäuren und aus der doppelsträngigen DNA werden zwei Einzelstränge.
Darauf folgt die Primärhybridisierung, auf Englisch primer annealing. Hierbei werden die beiden DNA-Einzelstränge schnell auf 50°C-65°C abgekühlt, um den Wiederaufbau der Wasserstoffbrückenbindungen zu verhindern. Gleichzeitig setzen sich die Primer aus den passenden Nukleotiden auf die DNA-Einzelstränge. An kurzen Sequenzen ist also wieder ein Doppelstrang entstanden.
In Schritt 3, Elongation genannt, kann die hitzebeständige Polymerase an den Primern ansetzen und polymerisiert die beiden Einzelstränge wieder zu Doppelsträngen. Somit hat sich die Anzahl von DNA-Doppelsträngen von eins auf zwei verdoppelt. Die Dauer der Elongation hängt von der Länge der DNA ab. Die Polymerase kann innerhalb von 30 Sekunden 500 Basenpaare erstellen. Die Temperatur hängt von der Polymerase ab und liegt meistens zwischen 68°C-72°C.
Diese Schritten können sehr schnell wiederholt werden. Der Thermocycler kann die Temperatur genau zum richtigen Zeitpunkt erhöhen oder senken, sodass sich die Anzahl von DNA-Doppelsträngen immer weiter verdoppelt.
Markierung
Die Sonde kann man aber immer noch nicht mit dem Auge erkennen. Dazu muss man sie noch irgendwie sichtbar machen. Dafür markiert man sie zum Beispiel radioaktiv oder über fluoreszenzmarkierte Antikörper.
Die radioaktive Markierung wird sehr häufig mit der α-32P-dATP-Markierung durchgeführt. Hierbei wird auf Adenin in der DNA das radioaktive Phosphorisotop 32P angesetzt, welches Betastrahlung abgibt. Diese Strahlung kann auf einem Röntgenfilm sichtbar gemacht werden.
Die Fluoreszenz an Proteinen oder Nukleinsäuren, wie sie bei der DNA und RNA vorhanden sind, wird meistens an den Aminogruppen angesetzt. Hierbei werden fluoreszierende Stoffe über Isothiocyanate (z.B. Fluorescein), Succinimidylester oder Sulfonylchloride (z.B. Dansylchlorid) an die Aminogruppen angehängt. Diese können dann mit Hilfe der unterschiedlichen Fluoreszenzspektren der markierten Sequenz und der Farbstoffumgebung durch molekulardynamische Effekte sichtbar gemacht werden.
Hybridisierung
Die geblottete Membran wird jetzt in eine Lösung der markierten Sequenz gelegt. Die zu untersuchende Sequenz wurde vorher durch Elektrophorese in einen getrennten Einzelstrang verändert. Dieser bildet mit dem markierten Einzelstrang einen nun markierten und damit sichtbaren Doppelstrang, soweit die Basen komplementär zueinander angeordnet sind. Komplementäre Basenpaare binden sich aufgrund von Wasserstoffbrückenbindungen aneinander und bilden einen relativ stabilen Doppelstrang. Diesen kann man jetzt mit verschiedenen Techniken sichtbar machen.
Die Hybridisierung ist also im Allgemeinen die Paarung der zu untersuchenden Sequenz und der markierten komplementären Sequenz, die vorher als Einzelstränge vorlagen und eine stabilen Doppelstrang bilden.
Um eine geblottete Membran analysieren zu können, müssen verschiedene Schritte ablaufen. Als erstes muss eine komplementäre Sequenz gebildet werden, diese muss passend markiert werden, damit man die gewünschte Sequenz sichtbar machen kann und letztendlich muss die Hybridisierung zwischen der zu untersuchenden Sequenz und ihrer komplementären und markierten Sequenz stattfinden.
Erst danach kann man durch verschiedene Verfahren, zum Beispiel dem Entwickeln von Röntgenpapier, die gewünschte Sequenz sichtbar machen und so nachweisen.
