1. Projektthema:
Mechanismen der Genexpression: intrazelluläre Proteintopogenese und Proteinfaltung
2. Projektbeschreibung :
Das übergeordnete Thema der Arbeitsgruppe sind Mechanismen der Proteinbiosynthese. Unter diesem Oberbegriff werden die Mechanismen der intrazellulären Proteinfaltung sowie Mechanismen des intrazellulären Proteintransports untersucht. In Hinblick auf Proteintransport werden Mechanismen des Imports von Proteinen in das endoplasmatische Retikulum bzw. in den Zellkern sowie Mechanismen des Exports von Proteinen aus diesen beiden Organellen in das Cytosol untersucht. Darüber hinaus wird das Proteom des endoplasmatischen Retikulums aus dem Pankreas mittels zweidimensionaler Gelelektrophorese und Proteinsequenzierung bzw. im Rahmen eines Kooperationsprojektes mittels Massenspektrometrie charakterisiert (http://www.med-rz.uni-sb.de/med_fak/biochemie/ER/index.html). Proteinfaltung im Cytosol und im endoplasmatischen Retikulum sowie der Austausch von Proteinen zwischen Cytosol und endoplasmatischem Retikulum werden in etablierten in vitro-Systemen studiert, die aus definierten Fraktionen von Säugetierzellen zusammengestzt sind und die Plasmid-abhängige Biosynthese definierter Modellproteine ermöglichen. Dabei geht es um die Identifizierung und Charakterisierung von beteiligten Komponenten sowie um die Aufklärung molekularer Mechanismen. Bei beiden Prozessen spielen molekulare Chaperone eine zentrale Rolle und bilden entsprechend einen Schwerpunkt der Arbeiten. Als Modellproteine kommen unter anderem Licht- bzw. Fluoreszenz-emmitierende Proteine (d.h. Luciferasen und GFPs) zum Einsatz, die auch mittels bildgebender Verfahren verfolgt werden. Die Komponenten werden auf zellulärer Ebene mittels der RNAi-Technologie und Fluoreszenzmikroskopie charakterisiert. Interessanterweise haben genetische Arbeiten kürzlich Mutationen in verschiednen Genen, die für einige der bearbeiteten Komponenten kodieren, als Ursache von neurodegenerativen Erkrankungen bzw. der autosomal dominanten polycystischen Lebererkrankung identifiziert. Darüber hinaus wurden ähnliche Mutationen bzw. die Überexpression von derartigen Genen in Assoziation mit humanen Tumoren beobachtet. Dieser Aspekt ist Gegenstand einer Zusammenarbeit mit der Arbeitsgruppe Wullich der Klinik für Urologie und Kinderurologie. Der Austausch von Proteinen zwischen Cytosol und Zellkern wird von Herrn Prof. Dr. Schlenstedt und seinen Mitarbeitern in etablierten in vitro-Systemen untersucht, die aus definierten Fraktionen bzw. Komponenten von Hefezellen bestehen. Auch hier geht es um die Identifizierung von beteiligten Komponenten sowie um die Aufklärung molekularer Mechanismen. Darüber hinaus werden die Komponenten auf zellulärer Ebene mittels Molekulargenetik und bildgebender Verfahren charakterisiert (Fluoreszenzmikroskopie). Zur Aufklärung molekularer Mechanismen werden generell Wechselwirkungen von an Teilreaktionen beteiligten Komponenten mittels Bindungsstudien (pull down assay) und Oberflächenplasmonresonanzspektroskopie (SPR) sowie im Rahmen von Kooperationsprojekten mittels Cryo-Elektronenmikrosokopie, Röntgenstrukturanalyse und elektrophysilogischer Methoden charakterisiert. Darüber hinaus werden Peptidbibliotheken bzw. mutierte Proteine für die Charakterisierung von interaktiven Proteinoberflächen verwendet.
Gene expression: components and mechanisms of intracellular protein transport and protein folding
Transport into the endoplasmic reticulum (ER) is the first biosynthetic step for secretory proteins. This highly regulated process is critical for the biosynthesis of many membrane proteins as well, and requires cytosolic and ER proteins, many of which were first identified using yeast genetics. The Zimmermann group studies the protein translocase that mediates the cotranslational insertion of proteins into the membrane of the pancreatic endoplasmic reticulum. Biochemical, biophysical, structural, and cell biological approaches are combined in order to elucidate the mechanism and the regulation of components of this protein translocase. The products of the SIL1, SEC62, and SEC63 genes act in concert with the Sec61 complex and the molecular chaperones BiP and Grp170 to transport proteins into the ER. A special emphasis is placed on transport components of the ER-membrane that associate with the tunnel exit of cytosolic ribosomes (such as Sec61 complex, ERj1, Sec62). Interestingly, recent genetic work has linked mutations in the human and murine SIL1 genes to neurodegeneration and mutations in the human SEC63 gene to autosomal dominant polycystic liver disease. Furthermore, mutations in the SEC63 gene and overexpression of the SEC62 gene are associated with various human cancers. This last aspect is the focus of a collaboration between the Zimmermann group and the clinic of urology (Wullich goup).
Small GTPases are key regulators in protein translocation into the endoplasmic reticulum (SRP, SRP receptor) and the cell nucleus (Ran). The Schlenstedt group studies the transport of proteins and RNAs between the nucleoplasm and the cytoplasm. This transport is mediated by specific shuttling receptors that belong to the importin beta-superfamily. The import of proteins containing a classical nuclear localization signal (NLS) is the best understood transport pathway. Several export routes and import pathways independent of classical NLSs have been identified. The group has a special interest in the role of the various transport receptors, the regulatory function of the Ran GTPase, and the Ran interaction partner Ran binding protein 1. In its analysis of nucleocytoplasmic transport the group employs yeast genetics, cell biological approaches, biochemistry, and structural studies.