Eigene Projekte

Meine Arbeitsgruppe beschäftigt sich seit einigen Jahren mit der Proteinkinase CK2. Wir konnten im Laufe der letzten Jahre viele Interaktionspartner und neue Substrate der Proteinkinase CK2 identifizieren. Dazu gehören Proteine, die für die Zellzyklusregulation, für die Proliferation und für so basale Prozesse wie das Spleißen von RNA wichtig sind. Ausgehend von diesen Befunden sollte eine Inhibition der CK2 gravierende Auswirkungen auf das Wachstum von Zellen haben. Vor allem am Zellkulturmodell des Prostatakarzinoms haben wir die Konsequenzen einer Hemmung der CK2 für das Zellwachstum untersucht. Mit allen verwendeten CK2-Inhibitoren – seien es Pflanzeninhaltsstoffe, seien es synthetisch hergestellte – konnten wir dramatische Auswirkungen auf die Lebensfähigkeit der Zellen nachweisen. Die Zellen sterben, wobei ein großer Teil der Zellpopulation durch Apoptose zugrunde geht.  Sichtbar wird dies z.B. am Auftauchen einer sub-G₁-Population,  an einer Spaltung der Enzyms PARP, an der Herunterregulation von Proteinen, die vor Apoptose schützen, an der Freisetzung des Cytochrom C aus dem Mitochondrium oder an der Aktivitätssteigerung von Caspasen. Das Wachstumssuppressorprotein p53, das an vielen Arten des Zelltods beteiligt ist, scheint in diesem Fall nicht unbedingt für die Auslösung und Exekution der Apoptose notwendig zu sein. Bemerkenswerterweise scheinen einige der Inhibitoren eine Änderung des Redoxstatus der Zelle zu veranlassen und führen zur Bildung reaktiver Sauerstoffspezies.

Da die CK2 eine Fülle verschiedener Substrate phosphoryliert, die durch eine Hemmung beeinträchtigt werden könnten und deren Expressions- und Aktivitätsänderungen entscheidend sein könnten für das Schicksal der Zellen, haben wir eine kleine Auswahl dieser Substrate untersucht. Wir fokussieren unsere Arbeiten momentan auf den  Androgenrezeptor AR, der für das Wachstum von Prostatazellen entscheidend ist, und die zellzyklusabhängige Phosphatase cdc25C, die für den Übergang von Zellen von der G₂ - in die M-Phase sorgt.

Der Androgenrezeptor

Der AR ist ein nukleärer Rezeptor der nach Bindung des Hormons Dihydrotestosteron durch Änderung des Proteinexpressionsmusters für das Wachstum und die Differenzierung von Prostatazellen sorgt. Seine Aktivitäten werden durch die Bindung des Liganden, durch Bindung an andere Proteine (Chaperone, Coaktivatoren, Corepressoren) aber auch über sein Phosphorylierungsmuster reguliert. Vor einigen Jahren wurde beschrieben, dass eine Kinase, die Charakteristika der CK2 zeigte, den AR phosphorylieren kann. Wir haben kürzlich zeigen können, dass nach Hemmung der CK2-Aktivität in Prostatacarcinomzellen sowohl die Expression als auch die Transkriptionsfaktoraktivität vermindert war. Das kann entweder darauf zurückzuführen sein, dass CK2 den AR als Substrat akzeptiert und seine Aktivität über eine Änderung des Phosphorylierungsstatus kontrolliert. In vitro kann der AR durch CK2 an einem Serinrest an Position 650 phosphoryliert werden. Auch andere Kinasen akzeptieren diese Aminosäure als Substrat, was sich u.a. in einer Änderung der nukleären Translokation und einer Änderung seiner Transaktivierungsqualitäten führt. Ob die Phosphorylierung durch CK2 ebenfalls in vivo eine Rolle spielt wird derzeit untersucht. Es kann aber auch sein, dass CK2 den AR nicht direkt sondern indirekt über seine Cofaktoren beeinflusst. Untersuchungen zu diesem Aspekt laufen im Moment ebenfalls.

Die zellzyklusabhängige Phosphatase cdc25C

Die cdc25C Phosphatase ist ein Enzym, das durch die Dephosphorylierung des Mitose promovierenden Faktors cdc2/Cyclin B die Progression von Zellen über den G₂/M Übergang fördert. Damit die Aktivierung zum richtigen Zeitpunkt des Zellzyklus erfolgt, greifen an cdc25C verschiedene Regulationsmechanismen an, darunter die Phosphorylierung bestimmter Aminosäurereste, insbes. des Serin 216. Dadurch wird eine Bindungsstelle für 14-3-3 Proteine geschaffen und eine cytosolische Retention der cdc25C während der Interphase erreicht. Während der Interphase scheint zumindest ein Teil der cdc25C Population an distinkte Strukturen gebunden zu sein und dort Aufgaben abseits der mitotischen cdc2 – Dephosphorylierung zu erfüllen. Wir konnten darüber hinaus zeigen, dass cdc25C von der Proteinkinase CK2 an Threonin 236 phosphoryliert wird. Dieser Aminosäurerest liegt in der Nähe des Kernlokalisationssignals (Aminosäure 239 – 245). Wir konnten zeigen, dass cdc25C mit Importin b interagiert und mit dem Importin a/b Heterodimer, nicht aber wie Proteine mit einem klassischen NLS mit Importin a alleine. Eine T236D Mutante ist in ihrer Fähigkeit, Importin zu binden, reduziert. Diese Mutante zeigte in einem Kernimport-Assay eine verzögerte Aufnahme in den Kern. Die Inhibition der CK2 in vivo durch den spezifischen Inhibitor Emodin hingegen resultierte in einer verstärkten nukleären Lokalisation von cdc25C. So scheint die Phosphorylierung von cdc25C an Threonin 236 ein wichtiges Signal für die cytoplasmatische Retention der dc25C zu sein.

Derzeit laufen Untersuchungen über die Auswirkungen auf das Schicksal der cdc25C nach Hemmung der CK2-Phosphorylierung.

Inhibitoren der CK2

Durch eine Kooperation mit der AG Prof. Dr. Joachim José, Institut für Pharmazeutische und Medizinische Chemie, Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf, haben wir Zugang zu neu hergestellten Inhibitoren für die Proteinkinase CK2, die bei uns auf ihre Eignung als zellmembrangängige Agenzien und auf ihre Spezifität und Selektivität gegenüber CK2 getestet werden. Der Kinaseinhibitor TF ((Z)-6,7-Dichlor-1,4-dihydro-8-hydroxy-4-[(4-methylphenylamino)-methylen-dibenzo [b,d]furan3(2H)-on) stellt einen hochpotenten in vitro Inhibitor der humanen Proteinkinase CK2 dar. Mit einem IC₅₀ Wert von 30 nM ist es der beste bisher bekannte Inhibitor dieses Enzyms. Die Aktivität von CK2 ist in Krebszellen erhöht und eine Hemmung dieses Enzyms stellt einen möglichen therapeutischen Ansatz dar.

In Zellkulturversuchen mit Prostatakarzinomzellen (LNCaP-Zellen) sowie mit HEK293 Zellen wurde festgestellt, dass TF die zelluläre CK2-Aktivität senkt, Apoptose einleitet und insgesamt zytotoxisch wirkt. In ersten Selektivitätsuntersuchungen stellte sich heraus, dass TF neben der CK2 nur 12 von 63 getesteten humanen Proteinkinasen >50 % hemmte. Das bedeutet, dass es sich bei TF um einen sehr selektiven Kinaseinhibitor handelt. Neben der CK2 wurden Aurora A, KDR, SGK1, FLT4, PIM1, PKD2, LCK, AMPKs und FLT1 gehemmt.

Lebensfähigkeit von HEK-Zellen nach Behandlung mit TF

Die Zellkulturuntersuchungen werden im Moment auf weitere Zelltypen ausgedehnt. Anliegen dieser Untersuchungen ist es, heraus zu finden, ob TF eine Wirkung auf alle Zelllinien gleich welchen Ursprungs und gleich welchen Malignitätsgrad hat. Ein Inhibitor, der normale Zellen weitestgehend verschont und Tumorzellen in ihrem Wachstum in Mitleidenschaft zieht oder sogar abtötet, wäre für die Entwicklung therapeutischer Strategien gegen den Krebs ideal.